1. 실시간 정량적 PCR
1996 년, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응 (실시간 qPCR) 이 미국에서 Applied Biosystems에 의해 처음 도입되었다. 소위 실시간 qPCR은 형광 신호를 연속적으로 모니터링하기 위해 PCR 반응에 형광기를 첨가하는 것을 말한다. 출현 순서 및 신호 강도의 변화는 표적 유전자의 초기 양을 실시간으로 분석하는데 사용될 수 있다. 이 기술의 발명은 정성에서 정량적 PCR로의 도약을 실현합니다.
2. PCR 형광에 사용되는 화학 물질
현재 실시간 qPCR은 사용 된 다양한 형광 화학 물질에 따라 형광 염료와 형광 프로브의 두 가지 범주로 나뉩니다.
3. PCR 형광에 사용되는 염료
형광 염료는 DNA 결합 염료라고도합니다. 현재 사용되는 주요 염료 분자는 SYBR Green I이다. SYBR Green I는 DNA 이중 가닥의 작은 홈에 특이적으로 결합 할 수 있습니다. 자유 SYBR 그린 I에는 형광 신호가 거의 없지만 이중 가닥 DNA에 결합합니다. 그 후, 형광 신호는 수백 배 증가 할 수 있습니다. PCR 생성물의 증가에 따라, PCR 생성물 및 염료의 결합량도 증가하고, 형광 신호의 강도는 이중 가닥 DNA 분자의 수를 나타낸다.
형광 염료의 장점은 사용하기 쉽고, 임의의 PCR 생성물과 조합될 수 있고, 저렴하다는 것이다.
일반적으로 SYBR Green I 방법은 가장 기본적이고 일반적으로 사용되는 실시간 qPCR 실험 중 하나입니다.
4. PCR 형광 프로브
실시간 qPCR에서 가장 일반적으로 사용되는 형광 프로브는 TaqMan 프로브입니다. 기본 원리는 표적 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 설계하고 합성하는 것이다. 프로브의 5 '말단은 형광단으로 표지되고, 3' 말단은 대기 그룹으로 표지된다.
정상적인 상황에서 두 그룹 사이의 공간 거리는 매우 가깝고 형광 유전자는 담금질로 인해 형광을 낼 수 없습니다. PCR 증폭 동안, 프라이머와 프로브는 동시에 주형에 결합하고, 프로브의 결합 위치는 상류 프라이머와 하류 프라이머 사이에 위치한다.
증폭이 프로브가 결합하는 위치로 확장 될 때 Taq 효소는 5 '엑소 뉴 클레아 제 활성을 사용하여 프로브에서 프로브의 5' 말단에 부착 된 형광 분자를 절단합니다. 형광을 유발합니다. 검출된 형광 분자의 수는 PCR 생성물의 수에 비례하므로, 초기 DNA 주형의 수는 PCR 반응 시스템에서의 형광 강도에 따라 계산될 수 있다.
TaqMan 프로브 기술은 형광 염료와 비특이적 증폭의 조합 문제를 해결합니다. 반응 후, 용융 곡선 검출이 필요 없으며, 이는 시험 시간을 단축시킨다.
TaqMan 프로브 기술의 장점은 낮은 형광 배경, 높은 감도, 높은 혼성화 안정성, 우수한 형광 스펙트럼 해상도 및 높은 특이성입니다.
TaqMan 프로브의 높은 특이성으로 인해 대립 유전자 차별, 특히 인간 유전자 다형성 및 SNP를 기반으로 균주를 구별 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
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