뉴스

1. 실시간 정량적 PCR

1996 년 미국의 Applied Biosystems에서 실시간 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (실시간 qPCR) 을 처음 도입했습니다. 소위 실시간 qPCR은 형광 신호를 연속적으로 모니터링하기 위해 PCR 반응에 형광기를 첨가하는 것을 말한다. 출현 순서 및 신호 강도의 변화는 표적 유전자의 초기 양을 실시간으로 분석하는데 사용될 수 있다. 이 기술의 발명은 정성에서 정량적 PCR로의 도약을 실현합니다.

2. PCR 형광에 사용되는 화학 물질

현재 실시간 qPCR은 사용 된 다양한 형광 화학 물질에 따라 형광 염료와 형광 프로브의 두 가지 범주로 나뉩니다.

3. PCR 형광에 사용되는 염료

형광 염료는 DNA 결합 염료라고도합니다. 현재 사용되는 주요 염료 분자는 SYBR Green I이다. SYBR Green I는 DNA 이중 가닥의 작은 홈에 특이적으로 결합 할 수 있습니다. 자유 SYBR 그린 I에는 형광 신호가 거의 없지만 이중 가닥 DNA에 결합합니다. 그 후, 형광 신호는 수백 배 증가 할 수 있습니다. PCR 생성물의 증가에 따라, PCR 생성물 및 염료의 결합량도 증가하고, 형광 신호의 강도는 이중 가닥 DNA 분자의 수를 나타낸다.

형광 염료의 장점은 사용하기 쉽고, 임의의 PCR 생성물과 조합될 수 있고, 저렴하다는 것이다.

일반적으로 SYBR Green I 방법은 가장 기본적이고 일반적으로 사용되는 실시간 qPCR 실험 중 하나입니다.

4. PCR 형광 프로브

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

정상적인 상황에서 두 그룹 사이의 공간 거리는 매우 가깝고 형광 유전자는 담금질로 인해 형광을 낼 수 없습니다. PCR 증폭 동안, 프라이머와 프로브는 동시에 주형에 결합하고, 프로브의 결합 위치는 상류 프라이머와 하류 프라이머 사이에 위치한다.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

TaqMan 프로브 기술은 형광 염료와 비특이적 증폭의 조합 문제를 해결합니다. 반응 후, 용융 곡선 검출이 필요 없으며, 이는 시험 시간을 단축시킨다.

TaqMan 프로브 기술의 장점은 낮은 형광 배경, 높은 감도, 높은 혼성화 안정성, 우수한 형광 스펙트럼 해상도 및 높은 특이성입니다.

TaqMan 프로브의 높은 특이성으로 인해 대립 유전자 차별, 특히 인간 유전자 다형성 및 SNP를 기반으로 균주를 구별 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.